FG Lerche

Das BMBF geförderte Treat-ION-Konsortium für neurologische Ionenkanal- und Transporter-assoziierte Erkrankungen hat seinen Fokus auf therapeutischen Studien in zellulären, tierischen und humanen Modellsystemen, welche durch in-silico Experimente komplementiert werden. Diese zielen auf die Erforschung neuer Behandlungsmethoden sowie genauere Vorhersagen der funktionellen Folgen von Mutationen ab. Die Verwendung zugelassener und verfügbarer Medikamente (“repurposed drugs“) wie 4-Aminopyridin ist hierbei ein wesentliches Ziel, um eine präzise Behandlung zu ermöglichen. Durch die molekularen therapeutischen Gremien der Deutschen Akademie für seltene neurologische Erkrankungen (DASNE) und die Zentren für Seltene Erkrankungen (ZSE) in Baden-Württemberg werden unsere Ergebnisse direkt an die Patienten übermittelt. Die funktionellen Auswirkungen ausgewählter Mutationen werden in neuronalen Expressionssystemen, wie transfizierten Primärneuronen der Maus, in-utero elektroporierten Neuronen und genetisch veränderten Tiermodellen, die eine humane Mutation tragen (sogenannte "humanisierte Mausmodelle"), untersucht. Der Vorteil sowohl von in-utero elektroporierten Neuronen als auch von genetisch veränderten Mausmodellen ist, dass Ionenkanäle mit einer pathologischen Variante unter physiologisch relevanten Bedingungen untersucht werden. Mittels Patch-Clamp Messungen können hierbei die intrinsischen, neuronalen Eigenschaften einzelner Neurone untersucht werden, wohingegen extrazelluläre Ableitungen sowie Multielektrodenarrays (MEA) zur Erforschung der Netzwerkaktivität dienen. Die Verwendung von 256-Elektroden MEAs sowie hochauflösender CMOS-Chips mit 4000 Elektroden erlaubt es uns einzelne Zellkompartimente und neuronale Netzwerkaktivität in Hirnschnitte von transgenen Tieren zu analysieren. Im Rahmen der DFG-Forschergruppe und insbesondere in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Garaschuk nutzen wir zudem in-vivo Ca^2+-Imaging, um die Netzwerkdysfunktionen unserer Mausmodelle weiter zu erforschen. Um genauer zu verstehen, wie in Folge eines genetischen Defekts Epilepsie entsteht, untersuchen wir die regionale und zeitspezifische RNA Expression mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung in verschiedenen neuronalen Subpopulationen der Mausmodelle.

Da humanes Hirngewebe eine limitierte Ressource in der neurowissenschaftlichen Forschung ist, generieren wir zusätzlich Neurone aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC). Diese stellen eine attraktive, wenn auch vereinfachte, Alternative eines humanen Modellsystems zur Untersuchung von Erkrankungen des Nervensystems dar.

Durch die Reprogrammierung patientenspezifischer Fibroblasten in pluripotente Stammzellen und die darauffolgende Überexpression spezifischer Transkriptionsfaktoren können wir gezielt exzitatorische und inhibitorische kortikale Neurone generieren. In anschließenden funktionellen Studien kann der Krankheitsmechanismus einzelner Patienten unter Berücksichtigung ihres einzigartigen genetischen Hintergrunds untersucht werden. Dabei untersuchen wir sowohl die Netzwerkaktivität mittels eines Multiwell-MEA-Systems, als auch die Einzelzellaktivität mittels Patch-Clamp Messungen. Somit konnten wir bereits zeigen, dass die entwicklungsbedingten elektrophysiologischen Aktivitätsmuster in iPSC-Neuronen mit denen von Menschen und Tieren vergleichbar sind (Rosa et al., Stem Cell Rep 2020). Aktuelle Projekte umfassen die elektrophysiologische Analyse patientenspezifischer iPSC-Neurone, welche pathologische Mutationen in Genen für Ionenkanäle (KCNA2, KCNH1) oder synaptische Proteine (STX1B) tragen.

Als weiteres humanes Modellsystem verwenden wir humane Schnittkulturen. Bei der Verwendung von humanem Liquor (CSF) als Kulturmedium, können die Schnittkulturen bis zu vier Wochen mit guten neurophysiologischen Eigenschaften in Kultur gehalten werden. Die Verwendung von ex-vivo-Gehirnschnitten, die aus adultem humanem neurochirurgisch reseziertem Gewebe stammen, ermöglicht die Untersuchung elektrophysiologischer Eigenschaften auf Einzelzell- und Netzwerkebene (Schwarz et al., Sci Rep 2017). Mit dieser Methode konnten wir erstmals zeigen, dass sowohl die neuronale Zytoarchitektur als auch die elektrophysiologischen Eigenschaften menschlicher Pyramidenzellen, wie auch Interneurone, stabil über 14 Tage erhalten bleiben. In weiteren Experimenten konnte durch eine optimierte virale Transduktion der Schnittkulturen ein High-throughput Verfahren für 3D-Rekonstruktionen GFP-markierter Zellen etabliert werden welche zukünftige Langzeit live Imaging von menschlichen Zellen in-vitro ermöglicht.